提取蛋白

1、所有试剂置于冰上预冷，PBS、RIPA、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂。PMSF室温保存。

• 蛋白酶抑制剂和PMSF是100X的。
• 磷酸酶抑制剂是50X的。

2、倒掉并充分吸干培养基，贴壁加入PBS冲洗3次。最终应当吸干所有的PBS（用1mL枪头套10μL枪头）。

3、配置细胞裂解液。对于6孔板，每孔大约需要100μL裂解液，一共可以配制大约700μL裂解液。

• 裂解液包括RIPA、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等，根据浓缩倍率进行配置。
• 裂解液需现配现用，在1min之内配置完成。

4、（6孔板）每孔加入100μL细胞裂解液，充分混匀，静置5-10min。

5、使用刮刀刮培养皿，将蛋白刮到培养皿的一角。

6、冰盒上静置20min，离心机14400×g，6min。取上清（不要吸到沉淀以及粘性液体）（一般100μL体积取60μL）。

蛋白定量

为了保证Western Blot中每个孔上样的蛋白总浓度是一致的，则应当首先进行蛋白浓度测定。而在测定之前，还需要用已知浓度的标准蛋白（一般是BSA，胎牛血清）制定标准曲线。

蛋白定量使用BCA法（二辛可酸法或二喹啉甲酸法）。BCA是一种碱性的水溶性复合物，性质稳定。在其提供的碱性环境下，蛋白质可以将BCA试剂中的Cu2+还原为Cu+，Cu+继而与BCA试剂螯合，从而产生蓝紫色的络合物，在562nm波长处具有强吸收峰，通过测定吸光度，结合标准曲线即可得知蛋白浓度。BCA法因抗干扰性强、简便准确，灵敏度高而得到广泛应用，但其也易受温度、孵育时间的影响。

1、配置不同浓度梯度的BSA溶液。

• 或者直接反复按1：2稀释即可。 √

2、配置BCA工作液

• 工作液总体积 = 所需96孔板孔数 * 200μL。
• 配制 BCA 工作液：50 体积的 BCA 试剂 A 中加入 1 体积的 BCA 试剂 B（A:B=50:1），充分混匀。

3、各取 5 μL 标准品和待测样品加入到微孔板中。每孔加入 195 μL BCA 工作液（即1：20的比例混匀蛋白溶液与BCA工作液），枪头吹打充分混匀。盖上微孔板，37℃ 孵育 30 min。

• 带入数据绘制标准曲线的时候需要将浓度乘以2。

4、在酶标仪上的 562 nm 波长范围处检测吸光度。

5、 根据 BSA 标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的 OD 值即最终的读数），绘制标准曲线。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

6、将各个样品稀释至相同浓度。

• 测定好蛋白含量的蛋白上清液以最低蛋白浓度的样品为参照，将所有样品蛋白浓度调到一致（有的实验室用裂解液调浓度，有的用buffer调浓度，有的用其他试剂来调浓度。根据自身实际情况选择），按照上样缓冲液说明书加入一定量的上样缓冲液（缓冲液中一般含指示剂，如溴酚兰），沸水浴或者加热到98℃-100℃处理10分钟使蛋白变性。待冷却后可以准备上样。
• 选择5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，加入至各样品管中。计算加入5X缓冲液之后的浓度与体积。
• 计算各管浓度乘以体积。
• 用1X的缓冲液补齐。

7、如果暂时不进行电泳操作，可将蛋白溶液放置于-80℃冰箱保存。再次使用时取出装有蛋白溶液的离心管，70℃煮3min即可，然后放在冰盒上以备上样。

• 膜蛋白一般用70℃
• 非膜蛋白一般用100℃

清洗玻璃板

1、清洗：洗洁精清洗玻璃板、37℃烘箱烘干。

2、装板：低的一面向内，确认玻板底部平齐，插入斜楔板压实卡紧。

配胶

根据目标蛋白的分子量确定分离胶的浓度：

配置各浓度1mL分离胶所需的各组分的体积：

配置1mL浓缩胶所需的各组分体积：

• Acr-Bis（丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺）：丙烯酰胺为单体，甲叉双丙烯酰胺（Bis）为交联剂。它们聚合形成凝胶网状结构。
• Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液）：提供稳定的pH（通常为pH 8.8用于分离胶，pH 6.8用于浓缩胶）
• SDS（十二烷基硫酸钠）：阴离子去污剂，使蛋白带负电荷并解折叠，从而按分子量分离。
• AP（过硫酸铵）：聚合引发剂，产生自由基以启动丙烯酰胺聚合反应。
• TEMED（四甲基乙二胺）：与AP协同作用，促进自由基形成，进一步加快聚合反应速率。加入TEMED后反应会加速进行，必须立刻灌胶！

实际实验中使用中晖赫彩$^®$的SDS-PAGE预混快速凝胶试剂盒（彩胶）来完成胶的配置。不同浓度的胶参照不同浓度的相关试剂盒的说明书进行配置，以配置15mm、15%的胶为例：

1、在15mL离心管中加入分离胶溶液和分离胶缓冲液各3.8mL。

2、加入1%体积的10%APS溶液（即76μL），轻轻吹打混匀，并立即将分离胶加入至胶板中间。在上方加入适量水以覆盖下方的胶层。室温放置15-30min，待分离胶凝固后倒去上层的水层。

3、另取5mL离心管，加入浓缩胶溶液和浓缩胶缓冲液各1.5mL。

4、加入1%体积的10%APS溶液（即30μL），轻轻吹打混匀，并立即将浓缩胶加入至胶板中间。

5、插上梳子。

6、室温静置10-15min，等待凝胶聚合。

7、如暂时不用胶，可将制备好的凝胶放入加油少量电泳缓冲液的密封袋中，4℃可存放数周。

上样与电泳

1、配置电泳缓冲液：使用预制的上样缓冲液干粉，1包干粉兑1000mLddH2O配成1000mL电泳缓冲液。一般使用2包粉+2LddH2O装入2.5L瓶子中混匀。

2、上样：将二块玻璃板制成的凝胶板子上的夹子卸去，将凝胶板垂直靠在电泳槽里的电源架上，使凝胶板的凹沿面靠向电源架。通常两块凝胶板共用一个电源架。将凝胶板与电源架按要求固定于电源槽内。（注意短板卡住绿色胶条）。按要求加入电泳缓冲液，注意在两块凝胶板中间电源架内的电泳缓冲液与加入在电泳槽中的电泳缓冲液应当互不相通。轻轻地拔去凝胶板内的梳子。整理梳齿。

3、取处理后的样品液，用微量进样器吸取适量样品液，将样品液缓缓加入凝胶板内地凹口部位(样品点入处)。注意不要冲散样品。

• 在第一个加样槽和最后一个加样槽中加入预染的marker各5μL。WJ101由15kDa-150kDa范围的9个蛋白条带组成(15kDa、20kDa、25kDa、35kDa、40kDa、50kDa、70kDa、100kDa、150kDa)。WJ102、WJ103和WJ106由10kDa-250kDa范围的11个蛋白条带组成(10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、35kDa、40kDa、50kDa、70kDa、100kDa、150kDa、250kDa)。由低到高的分子量范围可监测电泳过程中的蛋白分离情况、判断目标蛋白的分子量，并且可以监测WesternBlot实验中的转膜效率。25kDa、70kDa 两条带结合有红色或绿色染料，更便于实时观察电泳进程、判断蛋白分子量，其中 WJ106特别适用于近红分荧光成像系统。本品推荐上样量为5μL。

  

• 在其余各孔中加入约20μL样品。

2、电泳：用二根导线连接电泳槽与电泳仪，注意红色与黑色电极的插头和插口相配。电泳时上层胶使用低电压恒压电泳，打开电源将将电压调到80v（一般15min左右），而在溴酚蓝进入下层胶时使用高压恒压电泳，将电压调到120v至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

• 可以直接用120V跑完全程。

转膜

1、选择合适的膜：

• 硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜：NC 与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在 NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC膜韧性较差，易损坏。

• 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合，非常适合于低分子量蛋白的检测。但 PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1min。

2、配置转膜缓冲液：使用预制的干粉配置转膜缓冲液，一般使用2包干粉＋1600mL ddH2O + 400mL乙醇。

• 有些用乙醇，有些用甲醇

3、在SDS-PAGE电泳结束后，用薄板将凝胶板的两块玻璃轻轻撬开，使凝胶倾伏在其中一块玻璃板上。用刮板在凝胶上沿分离胶与浓缩胶的交界处，将分离胶切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品正反。然后将胶小心移入转膜缓冲液中。剪下与分离胶同样大小的0.45um的PVDF膜，用甲醇浸泡5s。剪下6张同样大小的滤纸，与PVDF膜、胶同时用转移缓冲液（转膜buffer）平衡15min。在转膜装置上从负极（黑底）到正极放置海绵垫片、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵垫片（由下而上），放置时一定要排除气泡。在转膜时还应当加入冰块保证冰冷的转膜环境。

4、将转膜板放置在电泳槽中，设置电流300mA。转膜时长与蛋白分子量有关。一般100 kb以内的蛋白，转膜时长为1kDa/1min；大于100 kb的蛋白，改为1kDa/1.5分钟。

• 使用快速转膜液，转膜30min

5、转完后，取出膜，在与胶相同的位置小心剪去一角，标示电泳方向及吸附有蛋白的膜面。

• 剪角时注意大分子在上，小分子在下

封闭

1、使用封闭液封闭非特异性位点，包括膜上的无蛋白空隙以及其它蛋白的抗原决定簇。封闭液可以使用：

• 5%脱脂奶粉/TBST缓冲液 摇床上室温封闭1h
• 5%BSA/TBST缓冲液 摇床上室温封闭1h
• 商业化Western低背景封闭及抗体增敏稀释液 孵育时间参考说明书

2、称量1.5gBSA粉末，与30mLPBS配成5%的BSA封闭液。

3、膜与5%BSA封闭液摇床上室温封闭1h

一抗孵育

1、弃去封闭液，TBST缓冲液冲洗3次（圆周摇床5min）。

• TBST，即Tris-Borate-Sodium Tween-20缓冲液。其配方（1X浓度）包括：100mL的10X PBS缓冲液，加入0.1%的Tween-20（1mL），再用ddH2O补足至1L以获得最终浓度。
• 可以不洗

2、配置稀释的抗体溶液：选用商业化抗体稀释液，对于目的蛋白，1：1000稀释抗体（即4mL的抗体稀释液+4μL的抗体）；对于内参蛋白抗体，1：5000稀释抗体（即5mL的抗体稀释液+1μL的抗体）。一抗多使用兔抗鼠的抗体。

3、裁膜（可选）：根据待检测的蛋白的分子量大小，将膜裁成连续的条带，每个条带上包含一个待检测的蛋白。

• 取干净的一次性薄膜手套，裁开两边，将PVDF膜夹在中间。用美工刀进行裁切，并切去一个小角以标记正反。

4、孵育盒酒精消毒并擦干，并用PBS冲洗数次，晾干。在孵育盒的每个槽中加入对应的抗体溶液，并放入对应的PVDF膜片段，在4℃冰箱里的摇床上孵育过夜。

5、回收一抗，TBST洗膜3次（圆周摇床10min）。

二抗孵育

1、加入用抗体稀释液稀释的二抗，室温孵育60min。

• 二抗常用羊抗兔抗体，1：10000稀释，并在常温摇床上孵育60min。

2、TBST 洗3次（每个槽大约加6mL，圆周摇床10min）。

显色

1、在暗室中将ECL试剂以1：1混合（约100ul），用滤纸将PDVF膜稍干燥后置于玻板上，滴加适量显影液在蛋白面上， 显影。

• 选择新赛美超敏ECL发光试剂盒NcmECL Ultra。
• 准备工作稀释液，将NcmECL Ultra Lumino/Enhancer Reagent（A）和NcmECL Ultra Stabilized peroxide Reagent（B）按体积比例1：1混合。
• 从TBST缓冲液中取出膜，小心移去膜上的多余缓冲液，但不要让膜干燥
• 将膜上有蛋白的一面向上放在托盘上，加上配好的工作稀释液，用量以覆盖膜为基准，1mL工作液可以覆盖大约 10 $cm^2$ 的膜
• 将膜与工作液孵育1-5min

2、通过成像仪进行成像。