细胞染色

常用细胞染料

DiD、DiR、DiO、DiI

DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常见的细胞膜染料,它们是一族亲脂性的荧光染料,用于细胞的形态学和结构研究。该系列染料进入细胞膜后,会在整个细胞膜上侧向扩散,在最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高,染色均一,荧光不易猝灭,无明显细胞毒性,且受自身荧光背景干扰小。

4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)

DAPI 即4’,6-二脒基-2-苯基吲哚,其为一种荧光染料,可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用,可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光,和EB相比,对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞,观察细胞标记的效率高(几乎为100%) 。DAPI染色常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟,在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。

DAPI 是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。它结合到双链DNA小沟的AT碱基对处,一个DAPI分子可以占据三个碱基对的位置。结合到双链DNA上DAPI分子的荧光强度提高大约20倍,常用荧光显微镜观测,根据荧光的强度可以确定DNA的量。另外,因为DAPI可以透过完整的细胞膜,它可以用于活细胞和固定细胞的染色。在荧光显微镜观察下,DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。单独DAPI的更大吸收波长为340nm,更大发射波长为488nm;当DAPI与双链DNA结合时,更大吸收波长为364nm,更大发射波长为454nm(10 mM Tris pH7.0,100 mM NaCl,10 mM EDTA),其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合,但产生的荧光强度只有与DNA结合的荧光强度的1/5,其发散光的波长范围约在500nm左右。

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罗丹明标记的鬼笔环肽(TRITC-Phalloidin)

鬼笔环肽(Phalloidin)可以特异性地结合细胞骨架,罗丹明(TRITC)标记的(TRITC- Phalloidin)可将细胞染成橙红色。

膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素酯(Annexin V-FITC)

钙离子依赖的磷脂结合蛋白Annexin V与早期凋亡细胞外翻的磷脂酰丝氨酸(PS)高亲和力结合,并通过FITC荧光标记进行检测。常与PI或7-AAD联合用于区分活细胞、早期凋亡和晚期凋亡/坏死细胞。

碘化丙啶(PI)

可渗入损伤细胞并嵌入双链核酸的碱基对间,结合DNA后发出强烈橙红荧光。正常完好细胞膜阻挡PI进入,细胞死亡膜完整性丧失时PI迅速进入细胞核与DNA结合。与Annexin V-FITC双染时,Annexin⁺/PI⁻视为早期凋亡、Annexin⁺/PI⁺为晚期凋亡或坏死。

7-氨基放线菌素 D(7-AAD)

DNA双链碱基间嵌插染料,偏好结合富含G-C的序列,形成的7-AAD/DNA复合物在488 nm和533 nm激光激发下发射远红光(峰值~647 nm)。正常活细胞膜不通透,细胞膜受损时进入细胞核与DNA结合。

γ-H2AX染色(Alexa Fluor$^®$ 488 Anti-gamma H2A.X)

核小体由组蛋白(Histone)和DNA组成,将DNA包裹并压缩成染色质,限制了DNA接近细胞内其它细胞器,因此,组蛋白在转录调控、DNA修复、DNA复制和染色体稳定性中发挥核心作用。真核生物中的组蛋白包含五种类型:H1、H2A、H2B、H3、H4。组蛋白H2AX是H2A的变体,在核小体中取代传统的H2A。紫外线灯等辐射可导致 DNA 损伤,在损伤后几分钟内,组蛋白H2AX的Ser139 位点会发生快速磷酸化。因此,第139位丝氨酸磷酸化的H2AX,被命名为gamma H2A.X,已被广泛用作DNA双链断裂(DSBs)的标记,来指示双链DNA损伤和凋亡。

三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)二氯化钌(II)($\pmb{[Ru(dpp)_3]Cl_2}$)

三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)二氯化钌(II),英文全名:(Tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline)ruthenium(II) dichloride),是一款发光探针(最大吸收波长absorption λmax:455 nm,发光最大吸收波长luminescence λmax: 613 nm),普遍用于氧(Oxygen)的检测和定量。由于动态淬灭的作用,分子氧引起[Ru(dpp)3]Cl2的光显著降低。因此,通过测定光强度或衰减时间来检测分子氧。[Ru(dpp)3]Cl2还被用于优化光学氧传感器,用于测定组织和皮肤瘤的氧流量,以及用于氧成像分析。

钙黄绿素-乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)

Calcein AM (Calcein Acetoxymethyl Ester,中文名称为钙黄绿素AM或钙黄绿素乙酰氧基甲酯),是在Calcein (钙黄绿素)的基础上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基团,加强了疏水性,因此能够轻易穿透活细胞膜。Calcein AM本身并无荧光,进入细胞后被细胞中内源性酯酶水解生成具有强负电荷的不能通透细胞膜的极性分子钙黄绿素(Calcein),从而被滞留在细胞内,而Calcein可发出强绿色荧光。与其它同类探针相比,由于Calcein AM的细胞毒性非常低,几乎不会影响细胞功能如细胞增殖或淋巴细胞的趋化性等,而且对pH值敏感性低,所以Calcein AM是目前染活细胞的最理想荧光探针之一。 由于死细胞缺乏酯酶,Calcein AM仅用于对活细胞的活力测试和短期标记,而核酸红色荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)由于不能穿透活细胞的细胞膜而只能染色细胞膜完整性被破坏的死细胞,所以Calcein AM常常与碘化丙啶联合使用,对活细胞和死细胞同时进行双重荧光染色(即活/死细胞染色)。 Calcein AM可以应用于大多数的哺乳动物细胞。有报道称Calcein AM也可以用于某些植物细胞如拟南芥(Arabidopsis)的根边缘样细胞(root border-like cells)及某些酵母如Pichia anomalaSaccharomyces cerevisiae。某些寄生虫如Leishmania由于细胞膜组分的原因,Calcein AM不能进入活细胞,但却可以进入凋亡早期的寄生虫细胞,从而与PI联用用于检测凋亡早期的寄生虫。由于真菌和细菌有细胞壁,会阻碍Calcein进入细胞,因此Calcein AM不适合用于真菌和细菌。 Calcein本身是一种金属络合指示剂,在生理pH条件下和Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe3+和Mn2+等金属离子络合时,荧光信号会发生淬灭。

细胞染色

一般流程

细胞染色的一般流程即培养-固定-染色-成像:

1、在超净台中打开共聚焦专用培养皿的灭菌包装,拿出培养皿,加入细胞悬液,盖上皿盖,放入培养箱中静置,等待细胞贴壁。常规细胞培养,待细胞长置合适密度再取出。

2、吸出培养基,以PBS清洗细胞,再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定细胞。

3、20分钟后,吸出固定液,加入0.1% Triton X-100。

  • Triton X-100是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂),它能溶解脂质,以增加抗体对细胞膜的通透性。1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本,0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清,配制BSA等,0.25%的Triton X-100 常用于细胞的通透。

4、10分钟后,吸出Triton,清洗细胞后加入BSA封闭。

5、加入抗体荧光染色后,吸出所有试剂,加入封片剂,可以开始共聚焦显微成像。

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