样本制备

对于悬浮细胞

1、制备 PBS/BSA 缓冲液（1X PBS 加入 1% BSA）。

2、将组织培养瓶中的细胞倒入 15 ml 锥形离心管中，400g离心5min。

3、弃去上清液，将沉淀重悬于 10 ml PBS/BSA 中，400g离心5min。

4、弃去上清液，用适量的 FACS缓冲液 重悬沉淀，调整细胞的浓度为1 × 10^7 个细胞/mL。

• FACS缓冲液由以下内容构成：
  • 1X PBS
  • 5%（v/v）的 FBS 或 BSA
  • 2mM EDTA
  • 2mM NaN3

对于贴壁细胞

1、收集培养基（不要倒掉，要保留死细胞）至离心管中。

2、加入EDTA-胰酶消化细胞（也可以用不含EDTA的胰酶，这样染色效果可能更好），这与细胞传代步骤一致。

3、离心、去上清、重悬。

4、计数。取5-10万重悬的细胞于离心管中，离心、去上清。加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。

对于储存在液氮中的细胞

1、制备 PBS/BSA 缓冲液（1X PBS 加入 1% BSA）。

2、与细胞复苏步骤一致：解冻、加入培养基、离心、去上清、PBS/BSA重悬。再次400g离心5min。

3、弃去上清液，将沉淀重悬于 10 ml PBS/BSA 中，400g离心5min。

4、弃去上清液，用适量的 FACS缓冲液 重悬沉淀，调整细胞的浓度为1 × 10^7 个细胞/mL。

对于新鲜组织

抗体染色

实验设计

设置同型对照和单染管

• 对于多色染色，需要设置N个单阳性对照管。

• 同型对照可用于评估因抗体类别引起的非特异性结合。同型对照是指与一抗的类别、亚型和荧光标记物一致但对目标靶点无特异性结合的抗体。通过检测背景染色，同型对照可以指示实验步骤是否需要进一步优化。同型对照可用于确定：

  ◆ 细胞是否充分封闭：如果未完全封闭，同型对照将与Fc受体结合。如果非特异性结合的原因在于细胞存在“粘性”，特别是死细胞的存在，则可在染色液中加入DNA酶。

  ◆胞内指标染色期间是否充分洗涤：针对细胞内靶标的抗体即使不与抗原结合，也常常会出现被拦在细胞内。

  同型对照一直是流式细胞术中最常用的阴性对照之一。但是，完全匹配的同型对照必须与待测抗体有着相同的免疫球蛋白重链和轻链，而且荧光染料与抗体的偶联比例也相同。在同型对照不满足这些要求的情况下，用户必须小心背景染色的过度解读2,5。对于多色流式组合，同型对照无法解释其他通道中的试剂所引起的背景荧光。FMO对照可以用来评估这种背景信号。

• 对于≥3种染色的情况还应当设置FMO对照，即仅缺某一种颜色的染色。

封闭

封闭细胞表面能够非特异性结合抗体Fc段的受体。可以用血清、血清中纯化的IgG、抗CD16/32的抗体或重组表达的Fc。

1、将样本置于冰上，以1μg/100μL的比例加入封闭液（抗小鼠CD16/32的抗体），4℃孵育20min。

固定 （用于细胞内抗原分析）

透膜 （用于细胞内抗原分析）

染色

不需要洗去封闭抗体，直接染色。

1、根据实验需要选择耦联合适荧光素的抗体。

2、用推荐的稀释度添加抗体5μL。充分混合，并在室温下避光孵育 30 分钟。

• 加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
• 加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
• 室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。

上机

前置知识

流式参数A、W、H

流式细胞仪检测信号时，每一个细胞通过激光，仪器都会检测到一个光信号，由PMT（光电倍增管）放大将光信号转换成电脉冲信号，从细胞进入检测点，到细胞离开检测点，电脉冲信号由0到达峰值，再降为0，被记录成一个峰值， H是电脉冲信号的高度（H, height），代表脉冲信号的峰值，W是脉冲信号的宽度（W, width），指细胞通过激光检测区域的时间，H和W是直接检测出来的，A指的电脉冲信号的面积（A, area），是经过仪器设置计算处理的。由于A是通过W和H的数值计算出来的，在仪器上分辨率会更高。

使用FSC-A和FSC-H组合可以用来去除黏连体，对角线位置上的是单细胞（2倍体和4倍体通过激光检测口时，H和A是成正比增大的，两者之间应该是呈45度角分布；而粘连体通过时，H不变，A增大），红色虚线框内面积更大的是黏连体。

LP、SP、BP滤光片

LP即Long Pass，只允许大于某一波长的光通过。SP即Short Pass，只允许小于某一波长的光通过。而BP即Band Pass，只允许指定波长附近波长的光通过。例如530/30 BP可以透过515-545 nm的光，而过滤掉其余波长的光。